Sind Ihre Messungen mit dem konfokalen Lasermikroskop zuverlässig? Selbstverifizierung mit dem 9-Punkte-Messtest
Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (Scanning Laser Confocal Microscopy, SLCM) hat sich zu einer beliebten Prüfmethode sowohl in Forschungslabors als auch in Produktionslinien entwickelt. Mit einer 405-nm-Laserlichtquelle werden bei der SLCM hochauflösende horizontale (XY ~200 nm) und vertikale (Z ~10 nm) Informationen kombiniert, um innerhalb von Sekunden ein dreidimensionales (3D) Bild zu erzeugen. Die Messskala von SLCM überlappt mit der optischen Lichtmikroskopie (OLM), der Rasterelektronenmikroskopie (REM) und der Rasterkraftmikroskopie (AFM). Darüber hinaus sind die Anforderungen an die Probenpräparation minimal. Die Mikroskope können Proben mit einer großen Bandbreite an Formen, einschließlich großer Größen, aufnehmen. Bei der SLCM sind keine Verbrauchsmaterialien erforderlich, und die Systemwartung ist minimal.All diese Vorteile machen die SLCM zu einer nützlichen Prüfmethode.Die folgende Tabelle fasst die Unterschiede zwischen diesen vier Verfahren zusammen.
Vergleich von konfokaler Laser-Scanning-, Rasterelektronen-, Rasterkraft- und optischer Lichtmikroskopie
| SLCM | SEM | AFM | OLM | |
|---|---|---|---|---|
| Vorbereitung der Probe | Nein | Ja | Ja | Nein |
| 3D-Bild | Ja | Nein | Ja | Nein |
| Verbrauchsmaterial | Nein | Nein | Ja | Nein |
| XY-Auflösung | ~100 nm | 10 nm | 0,1 nm | ~300 nm |
| Z-Auflösung | ~10 nm | N. zutr. | 0,1 nm | N. zutr. |
| Vakuum | Nein | Ja | Nein | Nein |
| Bildgeschwindigkeit | Schnell | Schnell | Langsam | Schnell |
Als hochauflösende Messtechnik zeichnet sich die SLCM durch eine hohe Genauigkeit und Wiederholbarkeit über das gesamte Sichtfeld aus. Eine Möglichkeit, die Genauigkeit und Wiederholbarkeit eines Systems zu bestätigen, ist die regelmäßige – in der Regel jährliche – Einholung eines Kalibrierzertifikats. Damit wird ein nach A2LA zertifizierter Servicetechniker beauftragt, der das Gerät mit einem auf NIST rückführbaren Kalibrierstandard testet. Es gibt jedoch eine einfache Möglichkeit, den Zustand eines Systems auf wöchentlicher oder monatlicher Basis zu überprüfen – mit einem einfachen 9-Punkte-Messtest (Abbildung 1).
Abbildung 1: Messung eines Merkmals an 9 Punkten im Sichtfeld, um zuverlässige Messungen zu gewährleisten. Die blauen Punkte zeigen die Position jeder Messung an.
Die Methode ist einfach. Wählen Sie zunächst ein leicht erkennbares Merkmal oder eine bekannte Probe aus. Messen Sie das Merkmal an 9 verschiedenen Stellen innerhalb Ihres Sichtfeldes, wie in Abbildung 1 dargestellt. Protokollieren Sie die Daten und führen Sie die Messungen an genau den gleichen Stellen erneut durch. Wenn die sphärische Verzerrung des Systems über das gesamte Sichtfeld gut kalibriert ist, sollten alle Daten mit geringen Abweichungen gleich sein.
Hier ist ein Beispiel unter Verwendung unseres konfokalen LEXT OLS5000 Laser-Scanning-Mikroskops. Dazu wurde eine Stahlplatte mit einer Vertiefung verwendet (Abbildung 2a), es empfielt sich jedoch, wenn möglich eine Standardkalibrierungsprobe zu verwenden. Die Tiefe der Vertiefung wurde an der tiefsten Stelle gemessen (Abbildung 2b). Dann wurde die Vertiefung an 9 verschiedene Stellen innerhalb des Sichtfeldes des Mikroskops verschoben und an jeder Stelle die gleiche Messung vorgenommen. Die durchschnittliche Tiefe betrug 6,976 µm, und die Differenz zwischen der minimalen und der maximalen Tiefe betrug 0,267 µm. Die Standardabweichung lag bei 9,6 %, was zeigt, dass das System genaue, reproduzierbare Messungen liefert.
 (a) |  (b) |
Abbildung 2: (a) Die Vertiefung auf einer Stahlprobe und (b) ein Diagramm, das die Messung zwischen dem höchsten Punkt am Rand und dem tiefsten Punkt der Vertiefung zeigt.
Um zu demonstrieren, wie wichtig die Verwendung der richtigen Optik ist, haben wir das für Messungen vorgesehene 50X LEXT Objektiv, das mit dem OLS5000 Mikroskop geliefert wird, gegen ein Standardobjektiv ausgetauscht, das nicht von Olympus stammt. Die Messvarianz erhöhte sich von 0,267 µm auf 0,911 µm, und die Standardabweichung stieg bis auf 34,7 %! Eine solch signifikante Abweichung der Messergebnisse desselben Merkmals zeigt, dass das Standardobjektiv unzuverlässige Daten lieferte. Diese Ergebnisse wären für die meisten Metrologielabors inakzeptabel und zeigen, wie wichtig dieser Schnelltest für die Gewährleistung der Leistung eines Systems ist.
 (a) |  (b) |
Abbildung 3: Die Höhendaten (a) mit einem speziellen LEXT Objektiv von Olympus (b) und einem üblichen Standardobjektiv, das nicht von Olympus ist.
Bei Metrologie-Anwendungen für Forschung und Fertigung sind Messgenauigkeit und Wiederholbarkeit entscheidend. Es ist zwar ratsam, ein System einmal im Jahr professionell validieren zu lassen, dies aber natürlich nicht auf wöchentlicher oder monatlicher Basis durchführbar. Glücklicherweise ist das hier vorgestellte 9-Punkte-Messverfahren eine schnelle und einfache Möglichkeit, um zu bestätigen, dass ein System weiterhin einheitliche Informationen liefert. Es könnte nützlich sein, dies in Ihr Standardverfahren für die Selbstverifizierung des Systems zu integrieren, um erhebliche Abweichungen der Daten zu vermeiden. Darüber hinaus zeigt dieser Test auch, wie wichtig es ist, die hochwertigsten Objektive zu wählen, die mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop verwendet werden können.
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