Von der Köhlerschen Beleuchtung profitieren

Eine Technik für eine gleichmäßige Ausleuchtung und einen hervorragenden Probenkontrast

Die kritische Beleuchtung war die vorwiegend verwendete Technik in der Mikroskopie. Bis August Köhler (1866–1948) eine neue Beleuchtungsmethode entwickelte, die heute als Köhlersche Beleuchtung bekannt ist. Das Problem bei der kritischen Beleuchtung bestand darin, dass die helle Lichtquelle ein Bild des Glühfadens in der Probenebene erzeugte. Die Sichtbarkeit des Glühfadens im Probenbild verursachte eine ungleichmäßige Ausleuchtung der Probe und führte zu Blend- und Schattenartefakten. Mit der neuen Köhlerschen Beleuchtung wurden diese Artefakte entfernt, da sie eine nicht fokussierte Lichtquelle verwendete, um die Probe gleichmäßig auszuleuchten.

Noch heute gilt, dass die Köhlersche Beleuchtung immer dann eingesetzt werden sollte, wenn eine unzureichende Probenbeleuchtung eine ordnungsgemäße Betrachtung beeinträchtigt. Die Köhlersche Beleuchtung bietet eine einheitliche Beleuchtung der Probe bei der Hell- und Dunkelfeldmikroskopie sowie allen Variationen des Phasenkontrasts mit Durchlicht oder Auflicht. Sie ermöglicht eine gleichmäßige Ausleuchtung, eine hohe Auflösung und eine klaren Probenkontrast.

Erfasstes Bild mit Auflichtmikroskopie. Bild ohne Köhlersche Beleuchtung (oben) und Bild mit Köhlerscher Beleuchtung (unten).

Welche Einstellungen sind für die Köhlersche Beleuchtung notwendig?

Durchlichmikroskopie: Die Köhlersche Beleuchtung erfordert verschiedene optische Komponenten des Mikroskops zwischen der Lichtquelle und der Probe. Diese Komponenten sind: Kollektor, Leuchtfeldblende, Öffnungsblende und Kondensor. Der Kollektor bildet das Licht der Lichtquelle fokussiert in der Ebene der Öffnungsblende ab. Der Kondensor projiziert dieses Licht dann durch die Probe.

Durch Einstellen der Leuchtfeldblende wird das Bild der Leuchtfeldblendenöffnung in der Probenebene auf eine Größe eingestellt, die etwas mehr als die des abgebildeten Bereichs der Probe beträgt. Dies entspricht dem Teil des Probenbildes, der auf Höhe der Sehfeldblende des Okulars zu sehen ist. Da die Leuchtfeldblende, die Probe und die Sehfeldblende des Okulars alle in derselben konjugierten Bildebene liegen, können die Beleuchtungsstrahlen aufgrund dieser Einstellung das Sehfeld des Okulars vollständig ausfüllen, während die durch die Sehfeldblende im Okular blockierte Fremdlichtmenge minimiert wird.

Auflichtmikroskopie: Die Auflichtmikroskopie oder Epi-Beleuchtung ist die Beleuchtung der Wahl für lichtundurchlässige Proben, wie Metalle, Erze, Keramiken, Polymere, Halbleiter (z. B. unbearbeitete Silizium-Wafer, integrierte Schaltkreise), Schlacken, Kohle, Kunststoffen und Lacke.

Die wesentlichen optischen Komponenten, die für die Köhlersche Beleuchtung im Auflichtmikroskop benötigt werden, sind entgegengesetzt zu den Komponenten in der Durchlichtmikroskopie angeordnet. Die Aperturblende des Kondensors befindet sich näher an der Lichtquelle und die Leuchtfeldblende befindet sich näher an der Probe. Bei der Auflichtmikroskopie hat das Objektiv zwei Funktionen. Bei der Abwärtsbewegung dient das Objektiv als ordnungsgemäß ausgerichteter Kondensor, der den Winkel des auf die Probe auftreffenden Lichts steuert. Bei der Aufwärtsbewegung bestimmt die numerische Apertur (NA) des Objektivs den Lichtwinkel, der erfasst wird, wenn die Probe ihn reflektiert hat. Je höher die NA, desto besser die Auflösung des Objektivs und desto besser die Auflösung der Probe.

Typischer Aufbau eines Auflichtmikroskops.

Wie wird die Köhlersche Beleuchtung verwendet?

Hellfeldmikroskopie: Das ist die meistverwendete optische Mikroskopietechnik. Die Beleuchtung der Probe erfolgt von oben über eine Wolfram-Halogenlampe, die durch die vertikale Beleuchtungseinrichtung über dem Tisch fokussiert wird. Das von einem Strahlteiler durch das Objektiv reflektierte Licht beleuchtet die Probe. Das von der Probenoberfläche reflektierte Licht tritt wieder in das Objektiv ein und gelangt in das Okular oder zu einem Kameraport. Absorption und Beugung des einfallenden Lichts durch die Probe führen häufig zu erkennbaren Abweichungen im Bild. Proben mit geringem Unterschied bei Intensität oder Farbe erfordern die Dunkelfeldmikroskopie oder den reflektierten differenziellen Interferenzkontrast (DIC) (siehe unten).

Bild eines Mikrochips mit Hellfeldmikroskopie.

Dunkelfeldmikroskopie: Sie eignet sich für Anwendungen, bei denen der Kontrast durch gestreutes Licht von der Probe entsteht. Licht, welches durch die Probe nicht gestreut wird, wird vom Objektiv nicht erfasst und nicht im Bild angezeigt. So erscheint das Feld um die Probe dunkel. Die Haupteinschränkung der Dunkelfeldmikroskopie betrifft die geringe Lichtstärke im betrachteten Bild. Hier hilft die Köhlersche Beleuchtung, mit der die Probe intensiv ausgeleuchtet wird. Erhöhte Merkmale, die zu glatt sind, um Schatten zu werfen, werden in Hellfeldbildern nicht angezeigt, das Licht, das von den Seiten dieser Merkmale reflektiert wird, ist jedoch in den Dunkelfeldbildern sichtbar.

Bild eines Mikrochips mit Dunkelfeldmikroskopie.

Phasenkontrastmikroskopie: Bei diesem Mikroskopieverfahren wird ein Probenkontrast über Interferenzen verschiedener optischer Weglängen des von der Probe reflektierten Lichts erzeugt. Die entstehenden Amplituden- und Phasenverschiebungen werden durch die Probeneigenschaften bestimmt. Diese Verschiebungen werden als Helligkeitsabweichungen aufgrund der Streuung und Absorption des Lichts angezeigt. Die Phasenkontrastmikroskopie ist besonders wichtig in der industriellen Mikroskopie, da sie viele Merkmale oder Strukturen einer Probe zeigt, die in der Hellfeldmikroskopie nicht sichtbar sind.

Ein Querschnittsbild von poliertem Metall mittels Hellfeldmikroskopie ohne Phasenkontrast (oben) und mit Phasenkontrast (unten).

Differenzieller Interferenzkontrast (DIC-Mikroskopie): Das ist eine neue Bildgebungsmethode mit Phasenkontrast. Die DIC-Mikroskopie verschärft den Kontrast durch die Erzeugung künstlicher Schatten, so als wäre die Probe von der Seite beleuchtet. Für die DIC-Mikroskopie wird polarisiertes Licht in zwei orthogonal polarisierte Teile aufgeteilt. Die beiden zueinander kohärenten Teile, die in der Probenebene räumlich verschoben (geschert) sind, werden dann vor der Betrachtung wieder zusammengefügt. Die Interferenz der beiden Teile bei der Zusammenfügung beruht auf geringsten Unterschieden ihrer optischen Weglänge, dem Produkt ihres Brechungsindex und ihrer geometrischen Weglänge. Der betrachtete Kontrast ist proportional zum Gradienten der Weglänge entlang der Scherrichtung, wobei ein dreidimensionales physikalisches Relief entsteht.

Ein Querschnittsbild von poliertem Metall mittels Hellfeldmikroskopie ohne DIC (oben) und mit DIC (unten).