Una tecnica che assicura un'ottimale illuminazione e un eccellente contrasto del campione
L'illuminazione critica è stata la principale tecnica di illuminazione adottata in microscopia fino a quando August Köhler (1866–1948) ha sviluppato un nuovo metodo di illuminazione conosciuto come illuminazione Köhler. Gli aspetti problematici dell'illuminazione critica erano legati alla creazione da parte della fonte di illuminazione di un'immagine del filamento della lampadina sullo stesso piano dell'immagine del campione. La visibilità del filamento della lampadina nell'immagine finale causava un'illuminazione del campione irregolare producendo riflessi e ombre. L'illuminazione Köhler ha risolto questi problemi utilizzando un'immagine sfuocata della fonte di luce per illuminare uniformemente il campione.
Ancora attualmente di valida applicazione, l'illuminazione Köhler dovrebbe essere impiegata quando l'illuminazione non ottimale del campione non permette un'osservazione corretta. L'illuminazione Köhler può assicurare un'ottimale illuminazione di campioni in campo chiaro, campo scuro e tutte le variazioni della microscopia a contrasto di fase mediante dei percorsi luminosi trasmessi o riflessi. L'illuminazione Köhler assicura un' illuminazione ottimale, un'alta risoluzione e un ottimale contrasto del campione.
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| Un'immagine acquisita mediante la microscopia a luce riflessa. L'immagine in alto è stata acquisita senza illuminazione Köhler mentre quella in basso con l'illuminazione Köhler |
Configurazione e uso dell'illuminazione Köhler
Microscopia a luce trasmessa: L'illuminazione Köhler richiede diversi componenti ottici del microscopio per essere applicata tra la fonte di luce e il campione: lente collettrice, diaframma di campo, diaframma del condensatore e lente del condensatore. La lente collettrice intercetta la luce dalla fonte di luce focalizzandola sul piano del diaframma del condensatore. La lente del condensatore proietta la luce attraverso il campione.
Regolando il diaframma di campo, l'immagine dell'apertura del diaframma di campo sul piano del campione viene definita a una dimensione leggermente superiore all'area del campione rappresentabile dall'immagine corrispondente alla parte dell'immagine del campione visibile al field stop dell'oculare. Visto che il diaframma di campo, il campione e il field stop dell'oculare si trovano tutti sullo stesso piano delle immagini coniugate, questa regolazione permette ai raggi luminosi di riempire completamente il campo visivo dell'oculare minimizzando allo stesso tempo la quantità di luce divergente bloccata dal field stop dell'oculare.
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Microscopia a luce riflessa: Microscopia a luce riflessa o epi-illuminazione rappresenta la scelta per l'illuminazione di campioni opachi come metalli, minerali, ceramiche, polimeri, semiconduttori (es. silicio non processato, wafer e circuiti integrati), scorie, carbone, plastiche e vernice.
Le componenti ottiche principali necessarie per definire l'illuminazione Köhler nella microscopia a luce riflessa sono sistemate con un'orientazione opposta a quelle presenti nella microscopia a luce trasmessa. Il diaframma dell'apertura del condensatore è più vicino alla fonte di illuminazione e il diaframma di campo è più vicino al campione. Nella microscopia a luce riflessa l'obiettivo possiede una doppia funzione: verso il basso l'obiettivo funziona come un condensatore allineato in modo ottimale, controllando l'angolo della luce che colpisce il campione, mentre verso l'alto l'apertura numerica (NA) dell'obiettivo determina l'angolo della luce che può essere intercettata quando viene riflessa dal campione. A parità di condizioni, all'aumentare dell'NA, migliora la risoluzione dell'obiettivo e la risoluzione del campione.
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| Tipica configurazione per un microscopio a luce riflessa. |
Modalità di applicazione delle tecniche di illuminazione Köhler
Microscopia a campo chiaro: La tecnica microscopica ottica più comunemente usata. L'illuminazione del campione viene trasmessa dall'alto attraverso una lampada alogena al tungsteno focalizzata attraverso l'illuminatore verticale posizionata al di sopra del tavolino. La luce riflessa da un prisma semiriflettente attraverso l'obiettivo illumina il campione. La luce riflessa dalla superficie del campione rientra nell'obiettivo e passa nell'oculare o nell'attacco per la fotocamera. L'assorbimento e la diffrazione della luce incidente da parte del campione spesso provocano delle variazioni percepibili nell'immagine. I campioni che mostrano una minima differenza in termini di intensità o colore richiedono una microscopia a campo scuro o un Contrasto a interferenza differenziale (DIC) riflesso (vedere di seguito).
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| Un'immagine di un microchip per un'osservazione a campo chiaro. |
Microscopia a campo scuro: Ottimale per le applicazioni dove i contrasti sono originati da una luce diffusa dal campione. La luce non diffusa dal campione non viene intercettata dalle lenti dell'obiettivo e non viene integrata nell'immagine. Di conseguenza il campo attorno al campione appare scuro. Il principale limite della microscopia a campo scuro è dato dai bassi livelli di luce visibili nell'immagine finale. Le tecniche di illuminazione Köhler contribuiscono a risolvere questo aspetto illuminando fortemente il campione. Elementi in rilievo con conformazione eccessivamente regolare per originare delle ombre non appariranno nelle immagini a campo chiaro, tuttavia la luce che si riflette al di fuori dei margini dell'elemento sarà visibile nelle immagini a campo scuro.
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| Un'immagine di un microchip per un'osservazione a campo scuro. |
Microscopia con contrasto di fase: Si tratta di una tecnica microscopica ottica che genera dei contrasti del campione derivati da interferenze con diverse lunghezze di percorso di luce riflessa dal campione. Si verificano delle variazioni di ampiezza e di fase in base alle proprietà del campione. Queste variazioni appaiono come delle differenze di luminosità derivate dalla diffusione e dall'assorbimento della luce. La microscopia con contrasto di fase è particolarmente importante per i microscopi industriali in quanto permette di rilevare numerosi elementi e strutture di un campione altrimenti non visibili con la microscopia a campo chiaro.
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| Un'immagine di una sezione trasversale di una componente metallica lucidata con osservazione a campo chiaro senza contrasto di fase (in alto) e con contrasto di fase (in basso). |
Contrasto a interferenza differenziale (microscopia DIC): Un nuovo metodo di imaging a contrasto di fase. La microscopia DIC migliora il contrasto creando delle ombre artificiali come se l'oggetto fosse illuminato lateralmente. Per realizzare la microscopia DIC la luce polarizzata viene separata in due componenti polarizzate ortogonalmente. Le parti reciprocamente coerenti, traslate spazialmente rispetto al piano del campione, vengono in seguito ricombinate prima dell'osservazione. L'interferenza delle due parti in fase di ricombinazione dipende dalle loro differenze del percorso ottico, dal prodotto del loro indice rifrattivo e dalla lunghezza del percorso geometrico. Il contrasto osservato è proporzionale al gradiente della lunghezza del percorso lungo la direzione trasversale fornendo l'aspetto di un rilevo fisico tridimensionale.
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| Un'immagine di una sezione trasversale di una componente metallica lucidata con osservazione a campo chiaro senza DIC (in alto) e con DIC (in basso). |
