Technika, która ułatwia równe oświetlenie i uzyskanie doskonałego kontrastu obrazu próbki
Do czasu, gdy August Köhler (1866–1948) opracował nową metodę oświetlenia, znaną dziś jako oświetlenie Köhlera, najczęstszą techniką oświetlenia stosowaną w mikroskopii była metoda krytyczna. Wadą oświetlenia krytycznego było jednak to, że jasne źródło światła generowało obraz swoich włókien w tej samej płaszczyźnie, w której odwzorowywany był obraz próbki. Włókna żarówki widoczne w ostatecznym obrazie powodowały nierówne oświetlenie preparatu i powstawanie artefaktów w postaci olśnienia i cieni. Metoda Köhlera wyeliminowała te artefakty, wykorzystując do równego oświetlenia próbki rozmyty obraz źródła światła.
Oświetlenie Köhlera to rozwiązanie wykorzystywane do dziś, którego warto użyć zawsze, gdy niedostateczne oświetlenie preparatu uniemożliwia jego poprawną obserwację. Metoda Köhlera pozwala na równe oświetlanie próbek w jasnym i ciemnym polu, a także we wszystkich wariantach mikroskopii z kontrastem fazowym, wykorzystując do tego drogi światła przechodzącego lub odbitego. System Köhlera ułatwia uzyskanie równomiernego oświetlenia, wysokiej rozdzielczości i odpowiedniego kontrastu próbki.
 |
 |
| Obraz zarejestrowany za pomocą mikroskopii w świetle odbitym. Obraz górny zarejestrowano bez oświetlenia Köhlera, obraz dolny — z oświetleniem Köhlera. |
Jak ustawić oświetlenie Köhlera i z niego korzystać?
Mikroskopia w świetle przechodzącym: metoda Köhlera wymaga, by pomiędzy źródłem światła a próbką znajdowało się kilka podzespołów optycznych. Należą do nich soczewka kolektorowa, przysłona pola, przysłona kondensora i soczewka kondensora. Soczewka kondensora zbiera światło i skupia je na płaszczyźnie przysłony kondensora. Następnie światło to jest kierowane przez soczewkę kondensora na preparat.
Dzięki dostosowaniu przysłony pola obraz apertury przysłony pola w płaszczyźnie preparatu ma rozmiar nieco większy od obrazowanego obszaru preparatu i odpowiadający części obrazu preparatu, którą widać przy przysłonie polowej okularu. Ponieważ przysłona pola, preparat i przysłona polowa okularu leżą na tej samej płaszczyźnie sprzężonej obrazu, takie dostosowanie pozwala odbitym promieniom całkowicie wypełnić pole widzenia w okularze, minimalizując przy tym ilość światła obcego blokowanego przez przysłonę polową okularu.
 |
Mikroskopia w świetle odbitym: mikroskopia w świetle odbitym, zwana także metodą oświetlenia od góry (EPI), służy do oświetlania nieprzejrzystych preparatów, takich jak metale, rudy, ceramika, polimery, półprzewodniki (np. krzem przed obróbką, wafle, zintegrowane obwody), żużel, węgiel, tworzywa sztuczne i farba.
Najważniejsze podzespoły optyczne potrzebne do zastosowania metody Köhlera w mikroskopii w świetle odbitym muszą być ustawiane w orientacji przeciwnej do tej, którą stosuje się w mikroskopii w świetle przechodzącym. Irysowa przysłona aperturowa kondensora znajduje się bliżej źródła światła, a przysłona irysowa pola jest umieszczona bliżej preparatu. W wypadku mikroskopii w świetle odbitym obiektyw pełni dwie funkcje — w kierunku do dołu służy za właściwie ustawiony kondensor, który reguluje kąt, pod jakim światło pada na preparat. W kierunku w górę apertura numeryczna obiektywu wyznacza kąt padania światła, które może zostać uchwycone, gdy odbija się od preparatu. Jeśli warunki pozostają niezmienne, im wyżej znajduje się apertura numeryczna, tym lepsza jest rozdzielczość obiektywu i próbki.
 |
| Standardowa konfiguracja mikroskopu do obserwacji w świetle odbitym. |
Jakie są zastosowania różnych wariantów oświetlenia Köhlera?
Mikroskopia jasnego pola: najpopularniejsza technika mikroskopii optycznej. Próbka jest oświetlana z góry przez żarówkę halogenową, której światło zostaje skupione za pomocą oświetlacza pionowego umieszczonego nad stolikiem. Światło odbite przez rozdzielnik wiązki za pośrednictwem obiektywu oświetla preparat. Światło odbite od powierzchni preparatu ponownie trafia do obiektywu, a następnie do okularu lub portu aparatu. Absorpcja i dyfrakcja przypadkowego światła przez preparat często powodują dostrzegalne różnice w obrazie. Preparaty, których intensywność lub barwa są zróżnicowane w niewielkim stopniu, wymagają zastosowania mikroskopii ciemnego pola lub mikroskopii w świetle odbitym z kontrastem różnicowo-interferencyjnym (DIC) (zob. niżej).
 |
| Obraz mikrochipu obserwowanego metodą jasnego pola. |
Mikroskopia ciemnego pola: świetnie sprawdza się tam, gdzie kontrast powstaje z powodu rozpraszania światła przez preparat. Światło, którego preparat nie rozprasza, nie jest zbierane przez soczewkę obiektywu ani włączane do obrazu. W efekcie pole widoczne wokół preparatu wydaje się ciemne. Główną wadą mikroskopii ciemnego pola jest niski poziom światła widocznego na ostatecznym obrazie. Tutaj przydaje się oświetlenie Köhlera, ponieważ próbkę trzeba intensywnie oświetlić. Wypukłe elementy, które są za gładkie, by rzucać cień, nie będą dostrzegalne na obrazach jasnego pola, ale światło odbite od ich boków będzie widoczne na obrazach ciemnego pola.
 |
| Obraz mikrochipu obserwowanego metodą ciemnego pola. |
Mikroskopia z kontrastem fazowym: technika mikroskopii optycznej, w której kontrast próbki jest generowany przez interferencję różnych długości drogi światła odbitego od preparatu. W zależności od właściwości preparatu dochodzi do zmian amplitudy i fazy. Zmiany te są widoczne jako różnice w jasności wynikające z rozproszenia i absorpcji światła. Mikroskopia z kontrastem fazowym jest szczególnie ważna w wypadku zastosowań przemysłowych, ponieważ ujawnia wiele elementów i struktur preparatu, których nie widać podczas obserwacji metodą jasnego pola.
 |
 |
| Obraz przekroju wypolerowanego metalu uzyskany podczas obserwacji w jasnym polu bez wykorzystania kontrastu fazowego (wyżej) i z kontrastem fazowym (niżej). |
Kontrast różnicowo-interferencyjny (mikroskopia DIC): nowa metoda obrazowania z kontrastem fazowym. Mikroskopia metodą DIC wzmacnia kontrast, generując sztuczne cienie, tak jak gdyby obiekt był podświetlony z boku. Aby mikroskopia DIC była możliwa, spolaryzowane światło trzeba podzielić na dwie prostopadłe spolaryzowane części. Te dwie wzajemnie spójne części, które są przestrzennie przesunięte (odkształcone) na płaszczyźnie preparatu, łączą się później ponownie, umożliwiając obserwację. Interferencja tych dwóch części w momencie ponownego złączenia zależy od różnic ich toru optycznego, ich współczynnika załamania światła i długości geometrycznej toru. Widoczny kontrast jest proporcjonalny do gradientu długości toru i kierunku odkształcenia; daje on efekt przypominający trójwymiarową rzeźbę terenu.
 |
 |
| Obraz przekroju wypolerowanego metalu uzyskany podczas obserwacji w jasnym polu bez wykorzystania metody DIC (wyżej) i z metodą DIC (niżej). |
