Esta técnica proporciona iluminação uniforme e excelente contraste da amostra
A iluminação crítica foi a técnica predominante em microscopia até que August Köhler (1866–1948) desenvolveu o novo método de iluminação, agora conhecida como iluminação Köhler. O problema da iluminação crítica era que o brilho da fonte de luz da lâmpada cria um filamento de imagem no mesmo plano da imagem da amostra. A visibilidade do filamento da lâmpada na imagem final causa iluminação irregular da amostra e apresenta problemas de brilho e sombreamento. A iluminação Köhler resolveu estes problemas através da utilização de imagem de fonte de luz desfocada para iluminar uniformemente a amostra.
Relevante ainda hoje, a iluminação Köhler deve ser utilizada sempre que a iluminação da mostra não for uniforme e impede a observação adequada. A iluminação Köhler pode fornecer iluminação de amostras em campo claro, campo escuro e todas as variações de microscopia de contraste de fase usando trajetos de luz refletida e transmitida. A iluminação Köhler simplifica a uniformidade da iluminação, a alta resolução e o contraste adequado da amostra.
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| Imagem capturada com microscopia de luz refletida. A imagem acima foi capturada sem iluminação Köhler e a imagem inferior com. |
Como devo configurar e usar a iluminação Köhler?
Microscópio de luz transmitida a iluminação Köhler precisa que vários componentes óticos funcionem entre a fonte de luz e a amostra. Isto inclui: lente coletora, diafragma de campo, diafragma do condensador e lente condensadora. A lente coletora age para coletar a luz da fonte de luz e a focaliza no plano do diafragma do condensador. Em seguida, a lente condensadora projeta esta luz em toda a amostra.
Ao ajustar o diafragma de campo, a imagem da abertura do diafragma de campo no plano da amostra é ajustada para um tamanho ligeiramente maior que a região da imagem da amostra, que corresponde a porção da imagem da amostra vista no campo da ocular. À medida que o diafragma de campo, a amostra e o campo da ocular param no mesmo plano de imagem conjugada, estes ajustes permitem que os raios de luz preencham todo o campo de visão ocular, minimizando a quantidade de luz divergente bloqueada pelo limitador de campo ocular.
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Microscopia de luz refletida: a microscopia de luz refletida ou epi-iluminação é a solução adequada de amostras opacas como metais, minérios, cerâmicas, polímeros, semicondutores (por exemplo, silício não processado, pastilhas, circuitos integrados), entulho, carvão, plásticos e tintas.
Os principais componentes óticos necessários para configurar a iluminação Köhler no microscópio de luz refletida estão dispostos em orientação oposta àquelas em microscopia de luz transmitida. O diafragma de abertura está mais próximo da fonte de luz e o diafragma de campo está mais próximo da amostra. No microscópio de luz refletida, a objetiva possui duas funções — no trajeto descendente a objetiva serve como condensador devidamente alinhado, controlando o ângulo da luz que atinge a amostra. No trajeto ascendente, a abertura numérica da objetiva (NA) determina o ângulo de luz que pode ser capturado conforme é refletido a partir da amostra. Se as condições forem idênticas, quanto maior for o NA melhor será a resolução da objetiva e da amostra.
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| Configuração típica para microscópio de iluminação refletida. |
Como as técnicas de iluminação Köhler são aplicadas?
Microscopia de campo claro: a técnica de microscopia utilizada com maior frequência. A iluminação da amostra é transmitida por cima por uma lâmpada de halogênio-tungstênio focalizada através do iluminador vertical posicionada acima da platina. A luz refletida pelo separador de feixe através da objetiva ilumina a amostra. A luz refletida a partir da superfície da amostra retorna à objetiva e passa pela ocular ou pela saída para a câmera. A absorção e a difração da luz incidente através da amostra originam variações discerníveis na imagem. Amostras que apresentam pouco diferença de intensidade ou de cor exigem microscopia de campo escuro ou contraste de interferência diferencial refletida (DIC, sigla em inglês) (veja abaixo).
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| Imagem de um microship em observação de campo claro. |
Microscopia de campo escuro: indicada para aplicações onde o contraste resulta de uma luz dispersada pela amostra. A luz não dispersada pela amostra não é coletada pela objetiva e não é incorporada à imagem. Consequentemente, o campo ao redor da amostra aparece escuro. A limitação principal da microscopia de campo escuro é o baixo nível de luz visto na imagem final. É assim que as técnicas de iluminação Köhler contribuem: a amostra deve ser bem iluminada. Os recursos amplificados muito uniformes para criar sombras não aparecerão nas imagens de campo claro, mas a luz que reflete nas laterais dos elementos serão visíveis nas imagens de campo escuro.
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| Imagem de um microship em observação de campo escuro. |
Microscopia de contraste de fase: técnica de microscopia ótica que cria contraste de amostra a partir da interferência de diferente comprimentos de trajeto de luz refletida a partir da amostra. A amplitude e as mudanças de fase ocorrem baseadas nas propriedades da amostra. Estas alterações mostram as variações no brilho a partir da dispersão e da absorção da luz. A microscopia de contraste de fase é particularmente importante na microscopia industrial, pois revela muitos elementos ou estruturas de uma amostra não visualizada em microscópio de campo claro.
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| Imagem de metal polido transversalmente sob observação de campo claro sem contraste de fase (acima) e com contraste de fase (abaixo). |
Contraste de interferência diferencial (microscopia DIC): um novo método de contraste de fase de imagem. A microscopia DIC consegue o contraste por intermédio da criação sombras artificiais, como se o objeto fosse iluminado lateralmente. Para realizar a microscopia DIC, a luz polarizada é separada dentro de duas partes ortogonalmente polarizadas. As partes mutuamente coerentes, que são deslocadas espacialmente (cortadas) no plano da amostra, são então recombinadas antes da observação. A interferência das duas partes na recombinação é sensível às diferenças da trajetória ótica, ao produto do índice de refração e comprimento da trajetória geométrica. O contraste observado é proporcional ao comprimento da trajetória da direção do corte, criando a aparência de um relevo físico tridimensional.
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| Imagem de metal polido transversalmente sob observação de campo claro sem DIC (acima) e com DIC (abaixo). |
