Методика, которая позволяет добиться равномерного освещения и наилучшего контраста для визуальных наблюдений
Критическое освещение превалировало в микроскопии до тех пор, пока Август Кёллер (1866–1948) не разработал новый метод освещения, называемый сейчас принципом освещения по Кёллеру. Проблема критического освещения была в том, что яркий источник света создавал изображение нити накала в той же плоскости, что изображение образца. Видимость нити накаливания лампы на финальном изображении вызывало неравномерное освещение, блики и теневые рисунки. Принцип освещения по Кёллеру устранил эти помехи, используя расфокусированное изображение источника света для равномерного освещения образца.
На сегодняшний день, освещение по Кёллеру используется всякий раз, когда подсветка мешает оптимальному визуальному наблюдению. Схема освещения по Кёллеру обеспечивает равномерное освещение поверхности образца в светлом и темном поле, и во всех вариациях фазово-контрастной микроскопии в проходящем или отраженном свете. Освещение по Кёллеру позволяет добиться равномерного освещения, высокого разрешения и хорошего контраста изображений образца.
 |
 |
| Изображение, полученное с помощью микроскопии в отраженном свете. Верхний снимок получен без освещения по Кёллеру, нижний снимок – с освещением по Кёллеру. |
Настройка и использование освещения по Кёллеру
Микроскопия в проходящем свете: Для настройки освещения по Кёллеру используется несколько оптических компонентов микроскопа между источником света и образцом. Сюда входят: коллекторные линзы, полевая диафрагма, диафрагма конденсора и конденсорные линзы. Коллекторные линзы собирают световые лучи из источника света и фокусируют их на плоскость диафрагмы конденсора. Конденсорная линза направляет пучок на образец.
При настройке полевой диафрагмы, размер изображения апертуры полевой диафрагмы в плоскости образца устанавливается несколько больше, чем зона изображения образца, соответствующая участку, видимому через окуляр. Поскольку полевая диафрагма, образец и диафрагма поля зрения окуляра находятся в одной сопряженной плоскости изображения, данная настройка позволяет световым пучкам полностью заполнить поле зрения окуляра, минимизируя бесполезный свет, блокируемый диафрагмой поля зрения окуляра.
 |
Микроскопия в отраженном свете: Микроскопия в отраженном свете или эпи-подсветка применяется для наблюдения непрозрачных образцов, таких как металлы, руда, керамика, полимеры, полупроводники (неочищенный кремний, пластины, интегральные схемы), шлак, уголь, пластик и краска.
Основные оптические компоненты, необходимые для настройки освещения по Кёллеру, в микроскопии в отраженном свете расположены в противоположном направлении по отношению к компонентам микроскопии в проходящем свете. Ирисовая диафрагма апертуры конденсора расположена ближе к источнику света, а полевая ирисовая диафрагма – ближе к образцу. В микроскопии в отраженном свете, объектив выполняет двойную функцию — по пути вниз объектив служит конденсором, контролируя угол луча, ударяющего образец. По пути вверх, числовая апертура объектива определяет угол луча света, отраженного от образца. При прочих равных условиях, чем выше числовая апертура, тем лучше разрешение объектива и разрешение изображения образца.
 |
| Типичная настройка микроскопа, работающего в отраженном свете. |
Как используется принцип освещения по Кёллеру?
Микроскопия методом светлого поля: Самый распространенный метод оптической микроскопии. Освещение образца производится сверху следующим образом: галогенная лампа накаливания излучает и фокусирует поток света на вертикальный осветитель, расположенный над столиком. Отраженный разделительной пластиной свет освещает образец через объектив. Световой луч отражается от поверхности образца, возвращаются в объектив, а затем проходит в окуляр. Поглощение или дифракция падающего луча при прохождении через образец часто приводит к видимым изменениям в изображении объекта. Для исследования образцов, отличающихся по интенсивности или цвету, рекомендуется использовать метод темного поля или дифференциально-интерференционный контраст (ДИК) в отраженном свете (см. ниже).
 |
| Микросхема, наблюдаемая методом светлого поля. |
Микроскопия методом темного поля: Изображение создается только лучами, рассеянными объектом, тогда как лучи света, отразившиеся от поверхности объекта, в объектив не попадают. Следовательно, поле вокруг образца видится темным. Основным недостатком метода темного поля является низкий уровень освещенности конечного изображения. Именно здесь поможет установка света по Кёллеру – для яркого освещения образца. Плавные неоднородности не могут быть наблюдаемы в светлопольной микроскопии, однако хорошо заметны на изображениях, получаемых методом темнопольной микроскопии.
 |
| Микросхема, наблюдаемая методом темного поля. |
Метод фазового контраста: Метод оптической микроскопии, где изображение формируется в результате интерференции отраженных от образца световых волн разной длины. Изменения амплитуды и фазы зависят от особенностей образца. Эти изменения проявляются в виде вариаций яркости в результате рассеяния и поглощения света. Фазово-контрастный метод особенно широко применяется в промышленной микроскопии, поскольку выявляет рельеф и структурные неоднородности поверхности образца, невидимые при наблюдении по методу светлого поля.
 |
 |
| Изображение поперечного сечения полированного металла, полученное методом светлого поля, без фазового контраста (сверху) и с фазовым контрастом (снизу). |
Дифференциальная интерференционно-контрастная (ДИК) микроскопия: Новый метод фазового контраста. ДИК-микроскопия увеличивает контраст изображения, создавая искусственные тени, как если бы объект был освещен сбоку. В ДИК-микроскопе поляризованный свет разделяется на два ортогонально поляризованных луча. Взаимно когерентные части, пространственно смещенные (сдвинутые) в плоскости объекта, затем воссоединяются. Интерференция обеих частей при воссоединении чувствительна к разности оптического пути лучей, рассчитываемого с помощью коэффициента преломления и геометрической длины пути. Наблюдаемый контраст пропорционален изменению длины оптического пути, создавая видимость трехмерного физического рельефа.
 |
 |
| Изображение поперечного сечения полированного металла, полученное методом светлого поля, без ДИК (сверху) и с ДИК (снизу). |
